ETUDE PAR ANISOTROPIE DE FLUORESCENCE DE LA DEFORMATION DE MEMBRANES CELLULAIRES SOUS CONTRAINTE DE CISAILLEMENT

Haïfa M. ABDUL-RAHIM

Notre travail a porté sur l’étude, par anisotropie de fluorescence de sondes membranaires extrinsèques, du comportement mécanique de membranes cellulaires.

Le milieu modèle choisi pour cette étude est une suspension de membranes isolées d’erythrocytes humains à la température de 25°C. Deux sondes ont été mises en oeuvre, le TMA-DPH et l’acide 6-(9-anthroyloxy) stéarique.

Une étude bibliographique permet de situer ce travail. De précédentes études de la déformation de membranes ou cellules sous cisaillement ont été réalisées par différentes techniques  la microscopie, la spectroscopie RPE, et principalement la diffraction de la lumière . L’emploi de l’anisotropie de fluorescence se présente donc comme une technique originale. Les quelques études théoriques du comportement mécanique des membranes ont été rassemblées afin d’aider à l’élaboration d’un modèle.

Un appareillage original a été mis au point, qui permet d’analyser l’anisotropie de fluorescence des sondes dans une suspension soumise à un cisaillement quasi-uniforme dans un montage de Couette. La mesure consiste à exciter le milieu avec une lumière polarisée et à analyser dans une direction donnée deux composantes polarisées croisées de la fluorescence émise. Deux directions de polarisation et deux couples de directions de polarisation d’analyse particulières ont été choisies. Dans un montage initial, deux composantes d’émission dont ont recherche le rapport sont mesurées successivement. La qualité de la mesure est nettement améliorée par un aménagement du montage initial permettant de mesurer simulanément les deux composantes.

Dans le but d’interpréter les observations expérimentales, un modèle a été développé. L’objet de ce modèle est de donner l’expression de toute composante polarisée de l’émission pour toute direction de polarisation de l’excitation. A cette fin, la membrane soumise au cisaillement est modélisée à partir du modèle de la capsule sphérique. Deux versions de la déformation sont considérées : dans un premier modèle la membrance est etirée selon une transformation affine et dans une seconde la membrane est déformée en un ellipsoïde quelconque. Le mouvement de la sonde est décrit en considérant divers mouvements de rotation externe ou interne. A partir de ces hypothèses, des expressions théoriques de l’intensité d’émission sont déterminées dont la complexité provient de l’absence de symétrie sphérique dans le cas de figure considéré .

Les résultats expérimentaux bruts montrent qu’un phénomène est bien obervé par l’emploi des deux sondes. Une certaine fluctuation prend place d’un échantillon à un autre , ce qui suggère une spécificité de la mesure. Cependant, le but de ce travail étant d’analyser la nature de l’information tirée de la mesure, nous prenons comme support de l’interprétation une moyenne de mesures sur plusieurs échantillons.

L’analyse par le modèle développé précédemment est en accord avec l’observation expérimentale des quatre rapports d’anisotropie mesurés, elle rend compte en particulier d’effets inverses en employant l’une ou l’autre sonde.

Il est vérifié que l’effet observé est essentiellement attribuable au comportement à l’échelle “macroscopique” de la membrane (déformation, orientation) et qu’un éventuel effect “microscopique” à l’échelle moléculaire de l’organisation du milieu lipidique n’est pas apparent. Les paramètres mesurés sont un paramètre géométrique de déformation de la membrane et un paramètre angulaire d’orientation de cette dernière dans l’écoulement.

Après discussion des variantes du modèle, le choix s’est porté sur le modèle de déformation en ellipsoïde quelconque, sans considérer l’élongation locale de la membrane, ce modèle conduisant au meilleur accord entre les informations obtenues avec les deux sondes. Les valeurs de l’indice de déformation mesurées sont en accord avec des valeurs de la litérature obtenues par d’autres techniques.

En complément de cette étude fondamentale, nous avons étudié le comportement des membranes sous de grands cisaillements en utilisant des adjuvants pour augmenter la viscosité du milieu. Cette opération est délicate; il a été observé que les adjuvants étaient en effet susceptibles d’altérer le comportement des membranes . L’emploi de polyvinylpyrrolidone de 360 000 g/mol a permis une étude qui confirme les tendances observées à faible cisaillement , avec cependant un certain désaccord avec les mesures effectuées par diffraction de la lumière.

Devant la difficulté d’effectuer des mesures sur des cellules intactes avec les sondes utilisées, nous avons mené quelques essais positifs avec une sonde très spécifique de la membrane (lipide portant un chromophore), qui encouragent à l’emploi d’une telle sonde dans notre technique.

 En conclusion, l’analyse de l’anisotropie de fluorescence de sondes membranaires extrinsèques permet d’atteindre les paramètres fondamentaux de déformation et d’orientation de la membrane cellulaire. L’appareillage est assez simple et les principes de l’analyse suffisamment définis pour envisager le développement de la technique dans le cadre d’études en biologie clinique.