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SYNTESE ET INGENIERIE DE L'AROMATIC L-AMINO ACID DECARBOXYLASE AADC (E.C.4.1.1.28) DU RAT

التبويبات الأساسية

Fatme A. JEBAI-RAMMAL

 

Univ.

Paris VII

Spéc.

Biochimie /Structure et Ingénierie des Protéines

Dip.

Année

#Pages

D.N.R

1997

159

 

La décarboxylase des acides aminés aromatiques (AADC), deuxième enzyme de la voie de biosynthèse des catécholamines (dopamine, adréaline, noradrénaline) et des indolamines (sérotonine, mélatonine), utilise le PLP comme coenzyme, elle appartient au groupe II de la famille a des enzymes à PLP.

Ce mémoire, est la description de l’approche génétique de l’étude structurale de l’AADC du phéochromocytome de rat. Il est présenté en deux parties:

1- Etude de plusieurs vecteurs d’expression permettant d’optimiser la production de l’AADC dans le cytoplasme d’E.coli :

le vecteur d’expression pET 20b+ s’est révélé particulièrement approprié à notre problématique. Il permet la purification de la protéine AADC, supplémentée de 6 histidines à l’extrémité C terminale, avec un rendement de 63% et une quantité de protéine de 2 mg/1 de culture bactérienne. Cette protéine est caractérisée par son activité spécifique élevée de 7500U/mg(1U= décarboxylation d’une nanomole de L-DOPA/min), par son Km=0,1 mM et par son Vmax =8000 U/mg. Ces valeurs sont semblables à celles obtenues pour l’AADC extraite de tissus de mammifères.

2- La construction par mutagenèse dirigée de plusieurs mutants de l’AADC. L’expression dans E.coli, ainsi que la caractérisation de chaque mutant par ses propriétés enzymatiques : Dans cette étude nous avons utilisé la méthode HCA (Hydrophobic cluster analysis) pour prédire la structure approchée de l’AADC, à partir de celles déja connues de l’Aspartate Aminotransférase, de la Tryptophanase et de la 2,2-dialkylglycine décarboxylase. Cette étude nous a ainsi permis de localiser un certain nombre de résidus du site actif de cette protéine. Nous nous sommes intéressés, en particulier, à l’étude de trois acides aminés (D271, C311,T246) susceptibles de participer au site enzymatique de cette enzyme. 5 mutations ont été réalisées (D271/A, D271/N, D271/E, T246/A, C311/A).

Le résidu D271 joue un rôle crucial au cours du mécanisme réactionnel de l’AADC, il forme une liaison hydrogène avec l’azote N(1) du PLP, ce qui favorise la délocalisation électronique et la diminution d’énergie du complexe enzyme-substrat. On aboutit alors à la transaldimination et à la formation du quinonoïde.

La mutation T246/A entraîne une baisse importante de l’activité spécifique. Cet acide aminé est impliqué dans la fixation du substrat.

Le remplacement de Cys 311 par  A la provoque une perte de 58% de l’activité enzymatique par rapport à l’enzyme non mutée. La diminution de l’acitvité spécifique est dû probablement à un rôle structural du résidu Cys, mis à l’évidence pour la première fois.

L’AADC présente des similitudes structurales avec la famille a des enzymes à PLP et en particulier avec l’aspartate aminotransférase, en se basant sur la structure tridimensionnelle déterminée par la méthode d’homologie structurale et sur les données récentes de la litterature, on peut proposer un modèle de décarboxylation de la L-DOPA par l’AADC.